Técnica Histologica
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS Y FUNDAMENTOS QUÍMICOS DE LA COLORACIÓN
En general, los métodos histológicos se clasifican en 2 grupos:
- Los que permiten la observación directa de células y tejidos vivos
- Los que analizan material muerto o inanimado
En un lugar intermedio se ubican las técnicas de aislamiento de los componentes de células vivas mediante métodos de centrifugación.
La mayoría de los componentes celulares no pueden ser visualizados directamente porque son transparentes a la región visible del espectro, con excepción de algunos pigmentos que absorben luz de ciertas longitudes de ondas. La célula viva presenta una baja absorción de luz por su alto contenido de agua, aunque luego de desecada sus componentes siguen presentando muy bajo contraste. Para contrarrestarlo se usa colorantes que permiten una absorción diferencial de la luz, pero en su mayoría no pueden utilizarse en células vivas.
ÍNDICE
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COLORANTES ÁCIDOS Y BÁSICOS
La mayor parte de los métodos de tinción histológicos se desarrollaron en función de su capacidad para teñir selectivamente los distintos componentes titulares. El color de una anilina no está relacionado con el hecho de que sea ácida o básica.
Colorantes ácidos
Un colorante ácido, como la eosina, tiene una carga neta negativa en su parte coloreada.
Reaccionan con los grupos catiónicos ( + ) de las células y los tejidos,
en particular con los grupos amino ionizados de las proteínas.
La reacción de los grupos catiónicos con un colorante ácido recibe el
nombre de acidofilia (afinidad por lo ácido)
Las reacciones de los componentes celulares y tisulares con los colorantes ácidos no son ni tan específicas ni tan precisas como las reacciones con los colorantes básicos. Aunque el enlace electrostático es el principal factor en la unión primaria de un colorantes ácido con el tejido, no es el único; debido a ello, los colorantes ácidos a veces se utilizan combinados para teñir en forma selectiva distintos componentes de los tejidos (por ejemplo en la técnica del tricrómico de Mallory) En otras técnicas con anilinas ácidas múltiples se emplea la hematoxilina para teñir primero los núcleos y luego se aplican los colorantes ácidos con el fin de teñir selectivamente el citoplasma y las fibras extracelulares. La tinción selectiva de los componentes tisulares por los colorantes ácidos se debe a factores relativos, como el tamaño y el grado de acumulación de las moléculas de colorante y la permeabilidad y densidad del tejido.
La tinción con colorantes ácidos es menos específica, pero más sustancias dentro de las células y en la matriz extracelular presentan acidofilia.
- La mayoría de los filamentos citoplasmáticos (proteínas), en especial los de las células musculares.
- La mayoría de los componentes membranosos intracelulares y gran parte del citoplasma no especializado de otro modo.
- Las mitocondrias, dado a que en su interior contienen muchas enzimas.
- La mayoría de las fibras extracelulares (principalmente por los grupos amino ionizados) (ej: colágeno)
Colorantes Básicos
Un colorante básico, tiene una carga neta positiva en su parte coloreada.
? Reaccionan con los componentes aniónicos ( - )de las células y los tejidos. La capacidad de estos grupos aniónicos de reaccionar con una anilina o colorante básico se denomina basofilia (Afinidad por lo básico)
La reacción de los grupos aniónicos varía según el pH. De esta manera:
- Con un pH ALTO (Cerca de 10): los tres grupos se ionizan y quedan disponibles para la reacción con el colorante básico por medio de uniones electrostáticas.
- Con un pH ligeramente ácido a neutro (5 a 7): se ionizan los grupos fosfato y sulfato y quedan disponibles para reaccionar con la anilina básica a través de uniones electrostáticas. Por ende, el ADN y el ARN presenta fuerte basofilia. Además, la mayoría de las proteínas citoplasmáticas son acidófilas.
- Con un pH BAJO (inferior a 4): sólo se mantienen ionizados los grupos sulfato para reaccionar con los colorantes básicos.
En consecuencia, la tinción con colorantes básicos a un pH determinado puede utilizarse para centrar el estudio en grupos aniónicos específicos y, dado que estos aniones específicos predominan en ciertas macromoléculas, la tinción sirve entonces como un indicador de estas macromoléculas. Para las tinciones histológicas comunes se utiliza un pH del que se conoce por experiencia su buen contraste de color. Con un pH elegido, algunos componentes tisulares son acidófilos, mientras que otros serán basófilos.
Los colorantes básicos verdaderos, a diferencia de la hematoxilina, no suelen usarse en secuencias en las que la anilina básica es seguida por una anilina ácida. La anilina básica tiene entonces a disociarse del tejido durante los lavados en soluciones acuosas que se realizan entre la aplicación de ambas soluciones colorantes. Estos colorantes también pueden utilizarse combinados o secuencialmente (por ejemplo, verde de metilo y pironina para estudiar síntesis y secreción de proteínas), pero estas combinaciones no son de uso tan difundido como las de los colorantes ácidos.
Entre los componentes aniónicos se encuentran los:
- grupos fosfato de los ácidos nucleicos
- grupos sulfato de los glucosaminoglucanos
- grupos carboxilos de las proteínas.
Componentes dentro de las células y de la matriz extracelular que presentan basofilia:
- Heterocromatina y nucléolos del núcleo (principalmente por los grupos fosfatos ionizados en los ácidos nucleicos de ambos)
- Ribosomas y polirribosomas (por ser ricos en ARN)
- Componentes citoplasmáticos como el Retículo Endoplasmático Rugoso (también por los grupos fosfato ionizados en el ARN ribosómico)
- Material extracelular como los carbohidratos complejos de la matriz cartilaginosa (por los grupos sulfato ionizados)
Metacromasia
Ciertos colorantes básicos reaccionan con componentes tisulares que hacen cambiar su color normal del azul al rojo o al púrpura; ésta modificación de la absorbancia se denomina metacromasia.
El mecanismo subyacente es la presencia de polianiones en el tejido. Una solución diluida de un colorante tiazínico como es azul, debido a que se encuentra como monómero. Cuando esos tejidos se tiñen con una solución colorantes básica concentrada, como la de azul de toluidina, las moléculas de la anilina están suficientemente cerca como para formar aglomeraciones diméricas y poliméricas. Las propiedades de absorción de estas aglomeraciones son diferentes de las moléculas de colorante individuales no aglomeradas.
Exhiben metacromasia las estructuras celulares y tisulares con una alta concentración de grupos sulfato y fosfato ionizados, como:
- la sustancia fundamental del cartílago,
- los gránulos de heparina de los mastocitos
- el retículo endoplasmático rugoso (RER) de los plasmocitos,
En consecuencia, el azul de toluidina se verá púrpura o rojo cuando tiña estos componentes.
Integrando
- El núcleo de una célula SIEMPRE es basófilo. Podrá ser intenso (si la cromatina está condensada) o leve (si la cromatina esta laxa). Pero siempre está en la gama de lo basófilo.
- Es el citoplasma de una célula el que tiene variaciones en la coloración. Esto depende fundamentalmente de las organelas que se encuentren en su interior.
- Una célula que sintetice proteínas de exportación, tendrá en su citoplasma grandes cantidades de REG. Esto no significa que UNICAMENTE tenga REG. También tiene mitocondrias.
La coloración final de un citoplasma depende SIEMPRE de la organela que predomine en su interior. Así, una célula que sintetice proteínas, tendrá mayor cantidad de REG que de mitocondrias, y por ende se teñirá su citoplasma basófilo. Lo mismo ocurre con una célula encargada de la contracción (tejido muscular). Si bien tiene polirribosomas para la síntesis de proteínas endógenas (las proteínas contráctiles), son estas últimas las que predominan en su interior, y por ende muestran un citoplasma acidófilo.
Hematoxilinia y Eosina : H & E
Es la técnica más utilizada. Tiñe los componentes nucleares de azul violáceo, mientras que casi todas las estructuras citoplasmáticas adquieren una tonalidad rosada. En consecuencia, la tinción con H-E muestra con nitidez la forma y la estructura del núcleo, además de la forma y la estructura del núcleo, además de la forma y la extensión de la célula.
- La hematoxilina, que es de color azulado violáceo, tenderá a unirse a moléculas ácidas. No es estrictamente un colorante básico, pero tiene propiedades tintoriales muy semejantes a las de las anilinas básicas. Los componentes del tejido que se tiñen con hematoxilina también exhiben basofilia.
Se usa como un mordiente (Es decir, un intermediario entre el componentes tisular y la anilina). Es por la acción del mordiente que la coloración con hematoxilina se parece ala tinción que produce un colorante básico. La unión en el complejo tejido-mordiente-hematoxilina no consiste en un simple enlace electrostático y cuando la hematoxilina se coloca en agua no se disocia del tejido. Por esto, la hematoxilina se presta para aquellos procedimientos tintoriales en los que a ella le siguen soluciones acuosas de colorantes ácidos.
- La eosina, que es de color rojo pálido o rosado, tenderá a unirse a moléculas básicas
PREPARACIÓN DEL TEJIDO
FIJACIÓN
La fijación es esencialmente un método para la preservación de la morfología y la composición química de la célula y los tejidos. Consiste en matar a las células, de manera tal que las estructuras que poseían éstas en el estado viviente se conserven con un mínimo de artificios a lo largo del tiempo y durante los procedimientos posteriores de preparación del tejido para su observación microscópica. Al mismo tiempo, algunos métodos tratan de mantener intacta su composición química. Debe realizarse inmediatamente después de extraer las células del organismo, de modo de evitar las lesiones agónicas producidas por la anoxia, que provocan inicialmente cambios osmóticas y luego alteraciones estructurales y bioquímicas más profundas. Por el mismo motivo, los fijadores deben actuar sobre fragmentos relativamente pequeños de tejido, de modo que la difusión del fijador desde las superficies hasta la parte central del bloque tisular se haga en un tiempo reducido. En este sentido, la velocidad de difusión del fijador debe ser lo más alta posible, y es característica de cada uno de ellos. En este proceso se estabilizan las proteínas, porque los fijadores favorecen la formación de enlaces cruzados entre las moléculas proteicas. Las proteínas solubles se unen a las estructurales y se transforman así en insolubles. De esta manera se mantienen todas las relaciones entre las estructuras como en la célula viva. La fijación también produce la inactivación de algunas de las enzimas celulares, las cuales de otro modo iniciarían la autodigestión o autólisis y conducirían a la degeneración post mortem. Además, se eliminan bacterias y muchos otros microorganismos, que podrían destruir el tejido.
Algunos agentes fijadores como el formol, el glutaraldehído, el bicromato y el bicloruro de mercurio dan lugar a fuertes uniones ente moléculas proteicas. Por ejemplo, el formaldehído (en solución al 4%), reacciona con los grupos amino, carboxilo e indol de las proteínas, y produce entonces uniones de metileno con otras moléculas proteicas. No reacciona con los lípidos y, por lo tanto, es un mal fijador de las membranas. En el glutaraldehído hay dos grupos aldehídos que pueden reaccionar con grupos amino situados en dos moléculas de proteínas adyacentes.
Hay cierta selectividad en la elección de fijadores, según la estructura o la sustancia que se prefiere preservar. Dado a que los cortes teñidos con H-E de muestras fijadas en formalina son convenientes porque dejan ver bien las características estructurales generales, no son específicos para dilucidar la composición química de los elementos constitutitos celulares. Además, muchos componentes se pierden durante la preparación de la muestra. Para retener estos componentes y estructuras hay que utilizar otros métodos de fijación. Algunos de los componentes que desaparecen son: proteínas y ácidos nucleicos pequeños, como los ARNt, moléculas grandes (por ejemplo, por ser hidrolizadas como consecuencia del pH desfavorable de las soluciones fijadoras). Algunas de estas moléculas son: Glucógeno, Proteoglucanos y glucosaminoglucanos. También se pierden componentes solubles, iones y moléculas pequeñas. Para el estudio de la cromatina y los cromosomas se emplean con frecuencia fijadores ácidos (generalmente ácido acético), y para el estudio de la actividad enzimática se usan la acetona, el glutaraldehído o el formaldehído, que producen una mínima desnaturalización y preservan muchos sistemas enzimáticos.
- Se sumerge la pieza alrededor de 24 hs en la solución fijadora. El volumen del fijador no debe ser menor de 10 veces el volumen de la pieza.
Método de congelación
Para conservar los lípidos neutros, como los de las células adiposas, debe evitarse el uso de alcoholes y los solventes orgánicos dado a que son diluyentes de lípidos. Por lo que deben utilizarse cortes de congelación de tejido fijado en formalina y colorantes que se disuelvan en las grasas. El alcohol y el xileno extraen grasas y el calentamiento de la inclusión inactiva muchas enzimas. Para evitar estos problemas, a veces se efectúa un corte por congelamiento de tejido fijado o no. Un taco de tejido congelado tiene consistencia suficiente para ser cortado en un crióstato. Los cortes se pueden tratar con las soluciones acuosas inmediatamente después de seccionados. La técnica de congelación es tan rápida que se pueden obtener secciones en pocos minutos. Se utiliza, por ejemplo, para determinar si el material de una biopsia extraída en un acto quirúrgico es benigno o maligno. El resultado de la biopsia se obtiene mientras el paciente permanece anestesiado, por lo que el cirujano puede decidir en el momento el alcance del procedimiento quirúrgico. En estas biopsias por congelación, la calidad de los preparados es apenas aceptable. Con este método se intenta lograr que la variación estructural y la extracción química sean las mínimas posibles, para conservar la actividad enzimática. Se congela rápidamente el trozo de tejido y se lo coloca en una cámara de vacío a baja temperatura, después se seca (Se deshidrata) por evaporación lenta (sublimación) del agua. (congelación-desecación)
INCLUSIÓN EN PARAFINA
Si bien los fijadores endurecen los tejidos, esta dureza no es todavía adecuada para obtener cortes lo suficientemente finos para ser observados. Por esto, el material debe ser embebido en substancias que lo endurezcan hasta el punto de poder ser seccionado sin deformación. Esto se logra mediante la inclusión
DESHIDRATACIÓN
Para usar parafina que es INSOLUBLE en agua, los tejidos deben ser previamente deshidratados. Consiste en pasar el preparado por concentraciones crecientes hasta llegar al alcohol etílico absoluto.
- SE hace con alcohol etílico de graduaciones crecientes: alcohol de 50º, 1 día; alcohol de 70º, 8 horas; alcohol de 96º, 14 horas; alcohol absoluto, 4 horas.
ACLARACIÓN
En este paso se pasa el preparado por sustancias para extraer el alcohol y disolver el material de inclusión (parafina). Estas sustancias son solventes orgánicos como xileno, benceno o tolueno., que son miscibles tanto en alcohol como en parafina.
- con dos cambios de xileno o benceno hasta aclararse (hasta 24 horas)
INCLUSIÓN
Para la técnica corriente se utiliza la inclusión en parafina.
- se sumerge la pieza en dos baños sucesivos de parafina fundida (56º-58ºC): a) 4 ó 5 horas; b) 1 hora.
FORMACIÓN DEL TACO y SECCIÓN DE LOS TEJIDOS.
La pieza se coloca en un molde, de preferencia metálico; se vuelca sobre él parafina fundida, se deja enfriar y se dejan secar Una vez incluido el material, se obtienen tacos de dureza suficiente que pueden ser cortados en aparatos especiales llamados micrótomos, que utilizan cuchillas de acero. Las secciones que se obtienen habitualmente tienen un espesor de alrededor de 5-10 ?m. Los cortes se recogen en portaobjetos para las preparaciones corrientes
- los cortes de parafina obtenidos en el micrótomo se pegan a portaobjetos de vidrio limpios y se dejan secar.
COLOREAR
Los cortes en parafina son incoloros, por lo tanto, la muestra todavía no está lista para su examen bajo el MO.
DESPARAFINIZACIÓN Para colorear o teñir los cortes histológicos la parafina debe disolverse y extraerse, de nuevo por xileno o tolueno, y los tejidos deben rehidratarse. Esto se debe a que la mayoría de los colorantes histológicos se utilizan en solución acuosa.
- se colocan los portaobjetos en un frasco Borrel o una jarra de Coplin y se agrega xileno dejándose 5 minutos.
HIDRATACIÓN
- se cambia el líquido del frasco reemplazándolo por alcoholes de concentración decreciente: absoluto, 96º, 70º (2 minutos cada uno). Luego se lavan los cortes 5 minutos con agua corriente
COLORANTE HEMATOXILINA El tejido sobre el portaobjetos se tiñe con hematoxilina en agua. ? se colocan en una solución madura de hematoxilina (1 g de hematoxilina en 1000 de agua ala que se agrega 0,2 de yodato de sodio, 50 g de alumbre de potasio y 50 g de hidrato de cloral).Se colorea 3 a 10 minutos según la diferenciación nuclear deseada.
LAVADO EN AGUA CORRIENTE
- 15 minutos hasta que vire de color.
COLOREAR CON EOSINA Como el colorante de contraste, eosina, es más soluble en alcohol que en el agua, se vuelve a deshidratar la muestra en soluciones alcohólicas de concentración creciente y después se tiñe con eosina en alcohol.
- 0,5 a 1% en alcohol, 30 a 60 segundos. El exceso de colorante se saca con alcohol.
MONTAJE
Tras la coloración, la muestra se hace pasar por xileno o tolueno y se coloca un medio de montaje no acuoso antes de cubrirla con un cubreobjetos para lograr un preparado permanentes.
- aclarar y montar en bálsamo o resina sintética, cubriendo la preparación con un cubreobjeto
OTRAS TÉCNICAS
Aunque los cortes teñidos con H-E de muestras fijadas en formalina son convenientes porque dejan ver bien las características estructurales generales, no son específicos para dilucidar la composición química de los elementos constitutitos celulares. Además, muchos componentes se pierden durante la preparación de la muestra. Para retener estos componentes y estructuras hay que utilizar otros métodos de fijación.
Algunos de los componentes que desaparecen son: proteínas y ácidos nucleicos pequeños, como los ARNt, moléculas grandes (por ejemplo, por ser hidrolizadas como consecuencia del pH desfavorable de las soluciones fijadoras). Algunas de estas moléculas son: Glucógeno, Proteoglucanos y glucosaminoglucanos. También se pierden componentes solubles, iones y moléculas pequeñas
Para conservar los lípidos neutros, como los de las células adiposas, debe evitarse el uso de alcoholes y los solventes orgánicos dado a que son diluyentes de lípidos. Por lo que deben utilizarse cortes de congelación de tejido fijado en formalina y colorantes que se disuelvan en las grasas.
[editar] Métodos basados en la reacción de Schiff para grupos aldehídos.
El reactivo de Schiff es la leucofucsina formada por el tratamiento del colorante rojo fucsina con bisulfito. La leucofucsina es incolora, pero forma un producto de adición estable rojo con los grupos aldehído. Esta reacción se incluye como paso final de dos importantes métodos de tinción histoquímicas:
Método del ácido periódico-Schiff (PAS)
Se emplea para determinar la presencia de macromoléculas ricas en hidratos de carbono como el glucógeno y las glucoproteínas.
El principio del método de PAS se basa:
- El ácido peryódico (HIO4) oxida primero los grupos hidroxilo (-OH) libres de dos átomos de carbono adyacentes, por lo que se transforman en grupos aldehído.
- Al mismo tiempo se escinde la unión entre los átomos de carbono, por lo que se detiene la oxidación.
- Los grupos aldehído neoformados reaccionan entonces con el reactivo de Schiff, para dar lugar a la aparición del color rojo magenta característico
Varios componentes tisulares reaccionan con el método de PAS, se dice que son "PAS positivos";. Para determinar si una sustancia PAS + está compuesta por glucógeno se trata un preparado control con la enzima amilasa, que escinde el glucógeno específicamente, antes de realizar la tinción de PAS. Estructuras PAS +:
- Vacuolas de células caliciformes,
- Vesículas de almacenamiento de glándulas mucosas (como los acinos mucosos o mixtos),
- Vesículas de almacenamiento de glucógeno: como en el hepatocito o las células musculares,
- Glucocálix,
- Membrana basal.
[editar] Reacción de Feulgen
Es un método específico para la determinación histoquímica de ADN, sobre la base del contenido de desoxirribosa. Se eliminan los grupos purínicos del ADN por medio de una hidrólisis suave. De esta manera se abre el anillo de la desoxirribosa y se forma un grupo aldehído, que reacciona con el reactivo de Schiff, con aparición del color rojo característico en el sitio que corresponde al ADN. Como control se utilizan cortes tratados con la enzima desoxirribonucleasa antes de la tinción de feulgen. Por lo general, los materiales positivos para Feulgen se limitan a la cromatina nuclear. Las mitocondrias poseen ADN, pero en cantidad demasiado pequeña para ser detectada con el método de Feulgen. El ARN no se tiñe con el reactivo de Schiff porque no tiene desoxirribosa, La reacción del reactivo de Schiff con el ADN es estequiométrica y puede usarse, por lo tanto, en métodos espectrofotométricos para cuantificar el ADN en el núcleo de una célula.
Coloración Tricrómica de Mallory
Se usan tres colorantes ácidos:
- Azul de anilina : tinción selectiva hacia el colágeno.
- Fucsina ácida : tinción del citoplasma en general. Y también tinción de núcleos.
- Naranja G : tinción de eritrocitos.
Orceina y fucsina resorcina
Se utilizan para el material elástico
Impregnación argéntica
Se emplea para teñir las fibras reticulares y las membranas basales
Determinación histoquímica de lípidos
Después de la fijación de los lípidos con formalina se cortan secciones congeladas, para evitar la extracción de los lípidos mediante solventes orgánicos. Se utiliza con frecuencia los colorantes Sudán. Son casi insolubles en agua, por lo que se utilizan disueltos en alcohol diluido, que no disuelve las grasas. La tinción se produce cuando las moléculas del colorante se distribuyen entre los lípidos y el solvente, en relación correspondiente a la solubilidad en los dos medios. Para evitar la extracción del colorante y los lípidos se incluyen los cortes, después de la tinción, en un medio acuoso.
Los colorantes Sudán tiñen con intensidad los triacilgliceroles, como por ejemplo, en la tinción de los adipositos con rojo Sudán. El negro Sudán tiene gran utilidad en la tinción de las vainas de mielina de las fibras nerviosas, compuestas por lipoproteínas.
Estructuras que se tiñen con Sudán:
- Tejido adiposo blanco: presenta una gran vacuola lipídica que ocupa todo su citoplasma.
- Vainas de mielina de las neuronas
- Vesículas de almacenamiento de colesterol de las células productoras de hormonas esteroideas: como el espongiocito de la corteza suprarrenal.
- Retículo endoplasmático Liso (REL).
Determinación histoquímica de enzimas
Métodos inmunohistoquímicos
Radioautografía
Es un procedimiento citoquimico qeu se utiliza con el fin de localizar radioactividad emitida por isotopos que se hallan depositados en diferentes tejidos
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